Исследователи, финансируемые Национальным институтом здравоохранения, идентифицировали два белка, которые могут быть ключевыми компонентами давно желанного канала механотрансдукции во внутреннем ухе – месте, где механическая стимуляция звуковых волн преобразуется в электрические сигналы, которые мозг распознает как звук. Результаты опубликованы в нояб. 21 онлайн-выпуск The Journal of Clinical Investigation.
В исследовании использовались мыши, у которых были удалены два гена, TMC1 и TMC2. Исследователи выявили специфический функциональный дефицит в каналах механотрансдукции стереоцилий мышей (щетинистых выступах, которые возвышаются над сенсорными клетками внутреннего уха, называемыми волосковыми клетками), в то время как остальная часть структуры и функции волосковых клеток была нормальной.
Эти гены и белки, которые они регулируют, являются наиболее сильными кандидатами в многолетнем поиске канала трансдукции, который лежит в основе способности внутреннего уха воспринимать звук и передавать его в мозг. Эндрю Дж. Гриффит, М.D., Ph.D., заведующий отделом молекулярной биологии и генетики и отделения отоларингологии в Национальном институте глухоты и других коммуникативных расстройств (NIDCD) при NIH, и Джеффри Р. Холт, доктор философии.D., адъюнкт-профессор отделения отоларингологии детской больницы Гарвардской медицинской школы в Бостоне, был одним из руководителей группы, опубликовавшей результаты исследования.
"На протяжении многих лет NIDCD финансирует исследования с использованием генетических подходов для обнаружения и анализа генов, лежащих в основе наследственной глухоты," сказал Джеймс Ф. Бэтти младший., M.D., Ph.D., директор NIDCD. "Мы полагали, что эти исследования также помогут нам идентифицировать гены и белки, которые имеют решающее значение для нормального слуха. Теперь наши усилия, кажется, окупаются в этом открытии неотъемлемых компонентов в комплексе механотрансдукции."
Как и другие сенсорные клетки, канал трансдукции волосковой клетки считается ионным каналом – крошечным отверстием или порой в клетке, через которое электрически заряженные молекулы (ионы) проходят внутрь и наружу – и который действует как молекулярный механизм для поворота. звуковые колебания в электрические сигналы в улитке, органе внутреннего уха в форме улитки. Механотрансдукция в сенсорных волосковых клетках также лежит в основе чувства равновесия в вестибулярных органах внутреннего уха. Исследователи предположили, что канал должен располагаться на концах стереоцилий волосковых клеток, которые связаны системой горизонтальных нитей (называемых концевыми звеньями), которые соединяют более короткие стереоцилии с их более высокими соседями, так что весь пучок движется как одно целое, когда стимулируется звуком или движениями головы.
Доктора. Гриффит и Холт и их команда сосредоточились на TMC1, гене, названном в честь его трансмембранно-канальной аминокислотной последовательности. Доктор. Гриффит и другая команда сотрудников, финансируемых NIDCD, ранее открыли TMC1 как ген, мутации в котором вызывают наследственную глухоту у людей и мышей. Множественные области белка, кодируемого TMC1, выглядели так, как будто они могли бы проникать через плазматическую мембрану (внешнюю мембрану клетки, которая контролирует клеточный трафик) и действовать как рецептор или канал. Исследователи также сосредоточили внимание на TMC2, гене, который имеет структуру, очень похожую на TMC1, и имеет аналогичные мембранные домены в своем коде.
Ученые с помощью генной инженерии создали мышей с нокаутированными версиями двух генов, а затем скрестили мышей так, чтобы у некоторых не было функциональных копий TMC1 или TMC2, а у некоторых был нокаутирован один ген, но присутствовал другой. Это должно было помочь ученым определить избыточность функции генов, являющуюся следствием семейств генов, которые могут заменять друг друга, когда один из них удален или мутирован.
Команда заметила, что у мышей с нокаутом TMC2 был нормальный слух и не было проблем с балансом (проблемы с балансом могли указывать на проблемы с волосковыми клетками в вестибулярной системе), но что у мышей без функциональных копий TMC1 или TMC2 было классическое поведение мышей с головокружением ?? покачивание головой, выгибание шеи, нестабильная походка и круговые движения ?? и они были глухими. Мыши с нокаутом TMC1 тоже были глухими, но у них не было проблем с балансом. Глядя на срезы тканей внутреннего уха мыши с момента рождения, исследователи смогли увидеть экспрессию TMC1 и TMC2 в волосковых клетках вестибулярных органов и улитки с рождения. Но через неделю TMC2, по-видимому, отключился в улитке, в то время как он продолжал экспрессироваться в вестибулярных органах. Поскольку только TMC1 продолжает экспрессироваться в зрелой волосковой клетке улитки, исследователи предполагают, что TMC1 важен для слуха, а TMC2 – нет. Однако в вестибулярной системе экспрессия TMC2 может заменять TMC1 для поддержания вестибулярной функции.
Чтобы глубже понять свойства TMC1, ученые измерили электрическую активность волосковых клеток у мышей с двойным мутантом. Мыши, у которых не было функциональных TMC1 или TMC2, не имели токов механотрансдукции в своих клетках. Все остальные ионные каналы у мышей с двойными мутантами, по-видимому, функционировали нормально. Дефицит TMC1 оказался специфическим для механотрансдукции, а не просто симптомом проблемы, которая затрагивает всю клетку.
Под сканирующим электронным микроскопом структура пучков двойных мутантных волосковых клеток выглядела совершенно нормальной, что исключало структурные аномалии, которые могли препятствовать трансдукции. Другие тесты проверяли наличие каналов механотрансдукции с использованием флуоресцентного красителя и гентамицина (лекарства, которое вызывает потерю слуха, повреждая волосковые клетки), оба из которых, как известно, свободно попадают в стереоцилии. Мыши с двойным мутантом не принимали ни одного вещества, в то время как нормальные мыши принимали.
Другой новый метод, адаптированный в лабораториях NIDCD для изучения волосковых клеток внутреннего уха, использовал генную пушку для запуска флуоресцентно меченных генов TMC1 и TMC2 в нормальной ткани, чтобы увидеть, где гены экспрессируют свои белки. Белки сгруппированы на концах стереоцилий, где их можно было бы увидеть, если бы они играли заметную роль в механотрансдукции.
Чтобы еще больше подтвердить свои выводы, исследователи обнаружили, что, используя технику генной терапии, которая добавляет белки обратно в клетку, они могут восстановить трансдукцию к вестибулярным и волосковым клеткам улитки мышей, у которых отсутствуют TMC1 и TMC2. Это говорит о том, что можно было бы обратить вспять генетический дефицит на клеточном уровне.
"Что мы видим в волосковых клетках этих мышей с двойными мутантами," говорит доктор. Гриффит, "представляет собой уникальную комбинацию свойств, которую можно было бы ожидать увидеть в волосковой клетке, имеющей дефектный канал трансдукции или какой-либо дефект в доставке этого канала туда, где он должен быть, и функционировании."
Чтобы точно узнать, как работает механизм канала, команда продолжит изучать, как TMC1 и TMC2 взаимодействуют друг с другом, а также как они взаимодействуют с другими белками на кончике стереоцилий, которые важны для трансдукции. К ним относятся кадгерины и протокадгерины концевых звеньев, которые также были идентифицированы и охарактеризованы в лабораториях, финансируемых NIDCD. Если эти гены кодируют канал трансдукции, они будут полезными инструментами для скрининга лекарств или молекул, которые связываются с каналом и могут быть использованы для предотвращения повреждения волосковых клеток.