Исследование, опубликованное сегодня в Aging Cell, определяет новый инструмент для точного анализа чрезвычайно редких делеций митохондриальной ДНК (мтДНК), связанных с рядом заболеваний и расстройств, а также со старением. Этот подход, основанный на технологии Droplet Digital PCR (ddPCR), поможет исследователям изучить делеции мтДНК как потенциальные биомаркеры заболевания.
Накопление мутаций мтДНК связано со старением, нервно-мышечными расстройствами и раком. Однако методы исследования механизмов, лежащих в основе этого мутагенеза, были ограничены из-за их неспособности точно количественно оценить и охарактеризовать новые события делеции, которые могут происходить с частотой всего одно событие делеции на 100 миллионов митохондриальных геномов в нормальной ткани. Чтобы устранить эти ограничения, исследователи из Центра онкологических исследований Фреда Хатчинсона в Сиэтле, штат Вашингтон, разработали анализ на основе ddPCR, известный как "Обнаружение цифрового удаления" (3D), который позволяет анализировать эти редкие делеции с высоким разрешением.
"Изучать мутации мтДНК, не говоря уже о делециях, в геноме невероятно сложно," сказал доктор. Джейсон Бьелас, помощник члена отдела наук об общественном здравоохранении онкологического исследовательского центра Фреда Хатчинсона и ведущий автор исследования. "Наш 3D-анализ показывает значительное улучшение специфичности, чувствительности и точности по сравнению с традиционными методами, такими как те, которые основаны на ПЦР в реальном времени."
Bielas добавил, "Увеличение пропускной способности, обеспечиваемое цифровой ПЦР с каплями, сократило анализ событий делеции до дней по сравнению с месяцами при использовании предыдущих методов цифровой ПЦР. Без технологий мы не смогли бы сделать это открытие."
В центре исследования была система ддПЦР QX100 от Bio-Rad Laboratories. Используя систему QX100, Биелас и его команда проанализировали восемь миллиардов геномов мтДНК человеческого мозга и идентифицировали более 100000 геномов с делециями. Они обнаружили, что, вопреки распространенному мнению, большая часть увеличения делеций мтДНК была вызвана не новыми делециями, а скорее расширением предыдущих делеций. Они выдвинули гипотезу, что распространение уже существующих мутаций следует рассматривать как основной фактор, способствующий возрастному накоплению делеций мтДНК.
Как работает 3D-анализ
3D – это новый трехэтапный процесс, который включает обогащение молекулами, несущими делеции, разделение геномов на отдельные молекулы на капли для прямого количественного определения с помощью ddPCR и характеризацию точек останова с использованием секвенирования следующего поколения.
После завершения процесса обогащения с использованием методов, ранее разработанных Биеласом и его коллегами, концентрация молекул внутри капель регулируется с помощью системы QX100, так что большинство капель не содержат мутантных геномов, а небольшая фракция содержит только один. Этот процесс позволяет усилить каждую делецию без предвзятости и без появления артефактов, типичных для qPCR.
После амплификации делеции можно анализировать с помощью ddPCR для определения абсолютной концентрации мутантных молекул. Используя взаимосвязь между флуоресценцией капель и размером ампликона, Биелас и его команда смогли охарактеризовать размер и сложность (были ли они результатом нескольких клональных расширений или большого набора случайных делеций) редких митохондриальных делеций в образцах мозга человека.
Трехмерный анализ представляет собой важный новый инструмент, который позволит исследователям лучше изучить механизмы образования и распространения делеций, а также их роль в старении. Высокая пропускная способность и повышенная чувствительность цифровой ПЦР в каплях также позволят лаборатории Биэласа нацеливаться на другие низкоуровневые болезнетворные делеции мтДНК в скелетных мышцах, ткани мозга и крови.